Nyilvános adatelemzés

A SARS-CoV-2 törzsekre vonatkozó adatokat és a mintavétel dátumát a Chiléből származó szekvenciákból a Consorcio Genomas CoV2 webhelyről szereztük be a következő címen: https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Az oltási adatokat a Tudományos, Technológiai, Tudás- és Innovációs Minisztérium nyilvános adataiból szereztük be, amelyek a következő címen érhetők el https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (83-as termék).

Fertőzőségi vizsgálat

A különböző SARS-CoV-2 tüskefehérjéket hordozó pszeudotipizált vírusokat a korábban leírtak szerint állítottuk elő¹². Röviden, HIV-1-alapú SARS-CoV-2 pszeudotípusokat állítottunk elő HEK293T sejtekben a pNL4.3-ΔEnv-Luc és a megfelelő pCDNA-SARS-CoV-2 Spike kódoló vektorral 1:1 mólarányban történő transzfektálásával. Olyan kodonoptimalizált tüskét kódoló plazmidok, amelyekből hiányzik a C-terminális végének utolsó 19 aminosava (SΔ19), amelyről ismert, hogy elkerülhető az endoplazmatikus retikulumban való retenció¹² génszintézissel vagy testreszabott helyspecifikus mutagenezissel (GeneScript) kapták, és a következő mutációkat tartalmazták: A vonal (referenciaszekvencia), B vonal (D614G), B.1.1.7 vonal (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, A 614- 681, L716Q, F982S, D1118G, T1N). Mindegyik pszeudotípusú készítményt szobahőmérsékleten 18 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással tisztítottuk, a HIV-20 Gag p26 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems) segítségével mennyiségileg meghatároztuk, 138%-os magzati szarvasmarha-szérumban (Sigma-Aldrich) osztották ki, és -190 °C-on tároltuk addig. használat. Különböző mennyiségű pszeudotipizált vírust (amelyet a HIV-417 p484 fehérje szintje határoz meg) használtunk a HEK-ACE501 sejtek megfertőzésére, majd 614 órával később a szentjánosbogár-luciferáz aktivitást a Luciferase Assay Reagent (Promega) segítségével mértük Glomax 655 Microplate-ben. luminométer (Promega).

Semlegesítési vizsgálat

A pszeudotipizált vírusneutralizációs vizsgálatokat lényegében a korábban leírtak szerint végeztük¹². Röviden, a plazmaminták sorozathígításait (1:4-től 1:8748-ig) készítettük DMEM-ben 10% magzati szarvasmarha-szérummal, és mindegyik pszeudotipizált vírusból 5 ng p24-gyel inkubáltuk 1 órán át 37 °C-on, majd 1×10-ben.⁴ HEK-ACE2 sejteket adtunk minden egyes lyukba. A pszeudotipizált vírussal (A vonal) inkubált HEK293T sejteket (az ACE2-t nem expresszáló) használtunk negatív kontrollként. A sejteket 48 órával később lizáltuk, és a szentjánosbogár-luciferáz aktivitást Luciferase Assay Reagent (Promega) segítségével mértük Glomax 96 Microplate luminométerben (Promega). Minden egyes hígításnál kiszámítottuk a semlegesítés százalékos arányát, és az egyes minták ID50-értékét a GraphPad Prism 9.0.1 verziójával számítottuk ki.

statisztikai elemzések

A statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism szoftver 9.1.2-es verziójával végeztük. A SARS-CoV-2 pszeudotípusú vírusok paneljével szembeni neutralizáló antitesttiterek (NAbT-k) több csoportos összehasonlítását, valamint a NAb-reakciók nemi és dohányzási állapot szerinti összehasonlítását egy páros Wilcoxon előjelű rangsorolt teszttel végezték. A faktorváltozást az ID geometriai átlag titerének különbségeként számítottuk ki₅₀ a vad típusú pszeudotipikus vírushoz képest. A NAbT-k és az életkor vagy a BMI közötti korrelációs elemzést Spearman teszttel végeztük. A fertőzőképesség statisztikai elemzéséhez egyutas ANOVA-t és Tukey többszörös összehasonlító tesztet végeztünk. A ≤0.05 p értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Etikai jóváhagyás

A vizsgálati protokollt az Universidad de Chile-i Orvostudományi Kar Etikai Bizottsága (0361-2021 és 096-2020 számú projekt) és a Clínica Santa Maria (132604-21 számú projekt) hagyta jóvá. Minden donor aláírta a tájékozott beleegyezését, és mintáikat anonimizáltuk.

A Lambda variáns tüske mutációinak hatása a fertőzőképességre és a semlegesítő antitestek válaszaira

A június 3695-én a GISAID-nél letétbe helyezett 24 chilei szekvencia elemzése^th 2021 egyértelműen a SARS-CoV-2 Gamma és Lambda variánsainak dominanciáját mutatja az utolsó trimeszterben, ami együttesen az összes szekvencia 79%-át teszi ki.

Érdekes módon ezt az időszakot egy hatalmas oltási kampány jellemezte, amelyben a célpopuláció 65.6%-a (18 évesek és idősebbek) részesült teljes oltási programban június 27-én.^th 2021

Tekintettel arra, hogy a teljes sémával beoltott emberek 78.2%-a megkapta a Sinovac Biotech inaktivált CoronaVac vírusvakcináját, megpróbáltuk megvizsgálni a lambda variánsban jelenlévő tüskemutációk hatását a vakcina által kiváltott antitestek semlegesítő képességére.

Ehhez HIV-1-alapú SARS-CoV-2 pszeudotípusú vírusokat hoztunk létre, amelyek a Wuhan-1 referenciavonalból (vad típus; A vonal), a D614G mutációból (B vonal) és az Alfából (B vonal) származó tüskefehérjét hordozzák. .1.1.7), Gamma (P.1 származású) és Lambda (C.37 származású) változatok.

A víruselőkészítés során következetesen megfigyeltük, hogy a Lambda tüskét hordozó pszeudotipikus vírussal fertőzött sejtek szignifikánsan magasabb biolumineszcencia értékeket produkáltak a D614G mutánshoz vagy az alfa és gamma variánsokhoz képest, ami a lambda tüske fehérje által megnövekedett fertőzőképességre utal.

Ábra 1.A különböző tüskefehérjék által közvetített fertőzőképesség.

(A) A SARS-CoV-2 tüskeprotein és a tanulmányban használt változatok sematikus ábrázolása. A vonalak zárójelben vannak feltüntetve. RBD, receptor-kötő domén, CM; citoplazmatikus farok.

(B) Az egyes vonalak pszeudotípusainak titrálása ekvivalens mennyiségű HIV-1 p24 alkalmazásával. A szentjánosbogár luciferáz aktivitását relatív lumineszcencia egységként (RLU) mértük a fertőzés után 48 órával. Az átlagot és az SD-t egy reprezentatív három párhuzamos kísérletből számítottuk ki.

Ezt követően a fent említett pszeudotipizált vírusokat használva neutralizációs vizsgálatokat végeztünk 79 plazmaminta felhasználásával, amelyek az Universidad de Chile és a Clínica Santa María egészségügyi dolgozóitól (Santiago, Chile) vettek részt.

4 mintát kizártunk, mivel nem tudtunk ID50 titert kiszámítani. Az elemzett minták 73%-a nőknek felelt meg, átlagos életkoruk 34 év (IQR 29-43) és testmax indexe (BMI) 25 (IQR 22.7-27). A résztvevők 20.5%-a nyilatkozott úgy, hogy aktívan dohányzik az immunizálási időszak alatt. A mintákat átlagosan 95 nappal (IQR 76–96) vettük a CoronaVac vakcina második adagja után.

Megfigyeltük, hogy a vad típusú tüskefehérjét hordozó pszeudotipizált vírus semlegesítése 50%-os gátló hígítást eredményezett (ID₅₀) átlagos titer 191.46 (154.9 – 227.95, 95% CI), míg 153.92 (115.68 – 192.16, 95% CI), 124.73 (86.2 – 163.2, 95% CI, 104.57 CI ) és 75.02 (134.11 – 95, 78.75% CI) a D49.8G mutáns tüskeproteinjét hordozó pszeudotipizált vírusok, illetve az alfa, gamma és lambda variánsok esetében.

Azt is megfigyeltük, hogy az ID geometriai átlagtitere₅₀ a titerek 3.05-szeresére csökkentek (2.57-3.61, 95% CI) a lambda-csúcsot hordozó pszeudotipizált vírus esetében, 2.33-ra (1.95-2.80, 95% CI) a gamma-csúcsra, 2.03-ra (1.71, )2.41% 95-1.37. az Alpha spike esetében és 1.20 (1.55 – 95, 614% CI) a DXNUMXG tüskénél a Wild típusú tüskével összehasonlítva.

Vizsgálati kohorszunkban nem észleltünk összefüggést a nem, az életkor, a testtömeg-index (BMI) vagy a dohányzási állapot és a semlegesítő antitest-titerek között.

Ábra 2.Semlegesítési vizsgálat CoronaVac vakcinázottak plazmamintáival

(A) Változások a reciprok 50%-os neutralizációs titerben (ID₅₀).

Gamma (P.1 vonal) és Lambda (C.37 vonal) variánsok a vad típusú vírushoz képest. Az eredményeket az illesztett minták neutralizációs titereinek különbségeként mutatjuk be. P értékek az azonosító összehasonlításához₅₀ Wilcoxon előjeles rang teszttel számítják ki.

(B) A dobozdiagramok az ID medián és interkvartilis tartományát (IQR) jelezték₅₀ minden pszeudotipizált vírus esetében. A faktorváltozásokat a geometriai átlagtiter különbségeként mutatjuk be az ID-ben₅₀ a vad típusú pszeudotipikus vírushoz képest. A statisztikai elemzéseket a Wilcoxon egyező párok előjeles rang teszttel végeztük.

Adataink együttesen feltárták, hogy a Chilében és Dél-Amerika országaiban nagymértékben keringő, újonnan felismert Lambda variáns tüskeproteinje olyan mutációkat hordoz, amelyek fokozott fertőzőképességet és a CoronaVac által kiváltott semlegesítő antitestek elől való menekülési képességet eredményeznek.